肠道菌群对动物免疫的影响

1 肠道菌群及其分布1.1 正常肠道菌群的概念动物的环境中通常存在一层微生物或微生物层。在正常情况下，即动物处于健康状态时，不表现出异常或致病现象，称这层微生物为正常菌群或固有菌群和原生菌群。这些菌群是动物体内环境不可或缺的组成部分，对动物宿主有益无害。 1.2 肠道菌群分布人和动物的胃肠道内栖息着约30属500多种细菌，主要由厌氧菌、兼性厌氧菌和需氧菌组成，其中专性厌氧菌占99%以上，只有拟杆菌属双歧杆菌占细菌总数的90%以上。个体肠道菌群分为三个部分：（1）生理菌群与宿主存在共生关系。它们是专性厌氧菌，是肠道的优势菌群，如双歧杆菌、拟杆菌、真杆菌和消化球菌等是膜菌群的主要组成部分，具有营养和免疫调节功能。 (2)条件性致病菌与宿主共生，主要为兼性好氧菌，为肠道非优势菌群，如肠球菌、肠杆菌等，在肠道微生态平衡时无害。条件具有侵略性和对人类有害。 (3)致病菌多为传代菌，长期定植的机会很少。当达到生态平衡时，这些细菌的数量很少，不会引起疾病。如果数量超过正常水平，就会引起人类疾病，如变形杆菌、假单胞菌和常有的西氏梭状芽孢杆菌等。口腔内菌群高度复杂，但通过胃后被胃酸破坏，对胃肠道影响不大。胃的酸性环境极大地抑制了微生物的繁殖，减少了进入小肠的微生物数量。无酸胃中的细菌数量会明显增加。胃内除幽门螺杆菌或相关菌种外，多为革兰氏阳性需氧菌，如链球菌、葡萄球菌、奈瑟菌、乳杆菌和念珠菌等，细菌浓度通常低于103/ml。幽门螺杆菌是真正的胃部细菌，是胃炎的主要致病因素，也是溃疡病的重要致病因素。小肠是一个过渡区，肠液流量大到足以将细菌冲到远端回肠和结肠，然后再繁殖。十二指肠和空肠相对无菌，细菌浓度为0-105个/ml，主要菌种为革兰氏阳性需氧菌，包括链球菌、葡萄球菌和乳酸杆菌。回肠远端革兰氏阴性菌开始超过革兰氏阳性菌，常有大肠菌群和厌氧菌存在，细菌浓度为10.310.7/ml。通过回盲瓣，细菌浓度急剧增加100倍以上，达到1010-1012个/ml，厌氧菌超过需氧菌10.2-10.4倍。革兰氏阳性球菌，正常人结肠中的优势菌群是相同的，并且随着时间的推移保持稳定。这些常驻肠道细菌在维持健康的肠道功能方面发挥着关键作用。 2 肠道菌群对动物免疫的影响及机制？肠道菌群形成了一个庞大而复杂的微生态系统，具有重要的生理意义。包括抵抗病原体的侵袭，刺激机体免疫器官的成熟，激活免疫系统，参与多种维生素的合成，调节物质的新陈代谢等。 2.1 细菌屏障功能动物先天性或非特异性免疫反应，即机体免疫系统对各种异物的识别和清除，主要依赖于机体的屏障功能，包括正常菌群、机体皮肤粘膜、补体和其他抑制细菌的体液因子、杀菌、裂解等，吞噬细胞的吞噬作用等。从现代研究不难看出，正常菌群是机体屏障功能中极其重要的一个方面。肠道微生物定植抵抗力（colonization resistance.CR）于1971年由荷兰微生物学家Vanderwaaij教授提出。肠道内源性专性厌氧菌抑制潜在致病菌数量的能力，主要属于消化道好氧菌。 Vollaard认为，粪便中需氧革兰氏阴性杆菌、肠球菌和酵母菌的数量可以作为肠道微生物定植抵抗力的指标。双歧杆菌与肠杆菌的比值（B/E值）作为肠道微生物定植抵抗力的指标。 2.2 影响粘膜免疫分泌球蛋白（SIgA）是粘膜免疫的主要效应物，能有效中和粘膜上皮中的病原体，在粘膜内层捕获病原体，形成免疫复合物排出体外，发挥作用局部抗感染过程。起着关键作用。研究发现，双歧杆菌抑制其他肠道细菌的作用与诱导一种抗菌物质——分泌球蛋白（SIgA）有关。一些研究证明，乳酸菌粘附所占据的空间是防止其他细菌附着于阴道组织的重要保护机制。嗜酸乳杆菌在肠粘膜免疫中可发挥重要的免疫监视功能。口服干酪乳杆菌可增强宿主的粘膜免疫反应，促进肠道分泌免疫球蛋白（SIgA），即使喂食低剂量的干酪乳杆菌也能引起SIgA的分泌。也有报道短双歧杆菌能促进小肠淋巴组织B细胞增殖，诱导淋巴组织浆细胞大量分泌免疫球蛋白（SIgA），进而增强免疫功能的身体。 2.3 促进免疫器官的生长发育益生菌能促进机体免疫器官的生长发育和成熟，增加T、B淋巴细胞的数量，增加胸腺淋巴细胞中免疫球蛋白的含量，启动免疫反应。相关研究表明，在实验组中，免疫器官中的淋巴细胞密集，数量增加，浆细胞数量增加，中枢免疫器官淋巴细胞和上皮网状细胞数量增加，这表明免疫器官中淋巴细胞的发育和免疫功能。因此，T、B淋巴细胞源源不断地输送到周围免疫器官脾脏、盲肠扁桃体和全身的免疫组织中。成熟的T淋巴细胞在接受抗原刺激后，被激活、增殖并分化为T淋巴细胞，发挥细胞免疫功能。 B淋巴细胞受抗原刺激后，活化、增殖并分化为浆细胞，产生特异性抗体，发挥体液免疫功能，从而提高全身免疫系统，提高免疫功能。 2.4 激活免疫因子据研究报道，益生菌能显着激活巨噬细胞的活性和细胞因子介质的分泌，增强免疫功能，提高宿主的抗病能力。这些因素在某些情况下可以替代免疫调节剂，因为它们不仅能刺激造血活性，而且也能增强成熟细胞的功能。例如IL1，人类颗细胞集落刺激因子及少量的肿瘤坏死因子（TNF）能增强对感染的抵抗力。胃肠道中的正常菌群，生理作用十分明显，没有致病性，对宿主有免疫原性，抗肿瘤作用明显。细菌细胞表面结合的细胞因子对细菌调节机体一系列免疫反应是非常重要的。研究发现双歧杆菌能刺激免疫细胞分泌IL1，IL6的量增加，而IL1可促进T辅助细胞分泌IL2和B淋巴细胞分泌抗体，也能增强NK细胞的杀伤功能，对人类的多种肿瘤细胞具有直接的杀伤作用；同时，IL6则可促进B淋巴细胞的分化成熟，使之分泌抗体，又可直接诱导T淋巴细胞的增殖并参与了T淋巴细胞、CTL、NK细胞及LAK的细胞分化。口服丽珠肠乐后，T淋巴细胞亚群约有不同程度回升，尤以CD3，CD4及CD4/CD8比值显著。嗜酸性乳酸杆菌的细胞壁成分提取物能增加上皮内淋巴细胞的自然杀伤活性，并能促进其产生IL2。研究短小双歧杆菌作用时发现，靶细胞是巨噬细胞样的细胞，该细胞释放的活性因子直接对B细胞的分裂发挥效应。双歧杆菌WPG对T细胞的增殖和IL?2产生没有直接作用，但能诱导TNF-α，IL-β，IL-6，IL-10和IFN-α的mRNA表达。 　　2.5 干预细胞免疫  干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌可激活巨噬细胞功能，刺激人体产生免疫应答。还通过巨噬细胞和T细胞、NK细胞活性的增强来增强人体的免疫；巨噬细胞、NK细胞、T细胞的活化，有益于增强周围血管和局部淋巴结中淋巴细胞的免疫，T辅助细胞、NK细胞的增加，可使抑制性T细胞减少。吸附于人体的嗜酸乳杆菌具有抗菌活性，该菌株能吸附于分化的肠道细胞上，还可在体外抵抗幽门螺杆菌，杀灭入侵菌。 　　许多研究结果显示，乳酸菌能干预细胞免疫。乳酸菌、双歧杆菌能阻断许多微生物的入侵和粘附（位组抑制）。口服乳酸菌或双歧杆菌能刺激人体产生非特异性免疫。乳酸菌的某些菌株：鼠李糖乳杆菌（ATCC?53103），植物乳杆菌（VTT），乳酸球菌（ARH74），双歧杆菌动物亚种是肿瘤坏死因子TNF-α和IL-6的强有力的诱导剂。有些能刺激IL-10的产生，以增强免疫。? 　　2.6  和疫苗混合使用提高抗体水平  林志新等（1991）报道，光合细菌与传染性支气管炎疫苗（H-52）混合使用，具有提高实验组鸡的γ-球蛋白和对禽传染性支气管炎病毒（IBV）的特异性抗体水平。也有研究表明，在ND疫苗接种前后饲用益生素，可提高鸡血清中抗NDV血凝抑制抗菌体，延长抗体的高峰期。 　　2.7  具有免疫佐剂活性  Himanen等（1993）研究枯草芽孢杆菌的脂磷壁酸（LTA）和肽聚糖?磷壁酸复合物的生物活性时，发现两者均具有很强的免疫佐剂活性作用。地衣芽孢杆菌的免疫促进作用是机体经口服芽孢杆菌后，在肠道淋巴组织集合的抗原结合位点上直接作为免疫佐剂，或者通过调整宿主体内的微生物群，尤其是双歧杆菌菌群起主导作用，间接的发挥免疫佐剂的作用，提高机体的局部或全身防御功能。? 　　2.8  菌群失调对动物免疫的影响  菌群失调是指肠道正常菌群的种类、数量和比例发生异常变化，偏离正常的生理组合，转变为病理性组合状态。临床上以腹泻为最明显症状，其他如肠道菌群中潜在致病菌引起的内源性感染和一些过敏性疾病如特异性反应性湿疹、过敏性皮炎和炎症性肠病等，被认为与菌群变化致肠一屏障功能损害及免疫紊乱有关。随着抗生素的广泛应用，特别是抗菌谱过广，应用时间长，是引起菌群失调的主要诱发因素。同位素、激素及放射治疗和化疗均可在治疗疾病的同时降低机体免疫力，影响益生菌。使人体潜在的致病菌定植。手术、外伤、感染和肿瘤以及环境恶化等均可引起菌群失调。? 　　３  饲用抗生素、动物免疫和肠道微生物的相互作用? 　　饲用抗生素在饲用抗生素促生长机制的研究方面，以前人们多从微生物角度出发，认为是抗生素对肠道微生物的抑制作用。然而，通过分析从前的研究结果，结论并非如此。佟建明等（2000）采用多次屠宰连续采样的方法对金霉素影响肠微生物的结果以及在动物不同生长阶段的变化情况进行研究，提出 了饲用抗生素、动物免疫系统和肠道微生物的三元平衡的理论假设。 　　他认为饲用抗生素、免疫系统和微生物（以及其他抗原物质）通过一定时间的相互影响会逐渐建立一个三元平衡，而且这个三元平衡影响着抗生素是否具有促生长作用。三者之间建立的过程可以分为两个时期：一是反应期，在这个时期，新生的畜禽受环境中微生物以及饲料中抗原物质的刺激，机体的免疫系统开始产生免疫反应，饲用抗生素对微生物产生一定的抑制作用，同时有的抗生素还可以对免疫系统起直接的抑制作用。两种作用之和形成免疫屏障，减缓和降低动物机体的免疫反应。饲用抗生素在此期间以此对动物产生相对明显的促生长作用；二是平衡期，在这个时期，肠道微生物的数量增加到正常情况下的最高水平，抗生素与免疫系统联合作用使微生物的数量和免疫反应水平不再增加，三者的正反作用在此时形成相对平衡。此时抗生素对动物不产生相对明显的促生长作用。 　　因此，在实际生产中，作为饲料添加剂的抗生素水平宜以预防和促生长作用的剂量而不宜以治疗剂量长期添加。? 　　4  微生态制剂在畜牧业上的应用? 　　动物体内的正常菌群已被广泛开发研制成微生态制剂，用于促进动物的生长、提高饲料利用率和动物疫病的防制。? 　　4.1  微生态制剂的种类  根据微生态制剂的用途及作用机制可分为：微生态治疗剂、微生态多功能制剂即微生物饲料添加剂、微生态助长剂等。根据微生物的种类又可分为： 　　（1）芽孢杆苗制剂：目前已应用于生产的芽孢杆菌主要有蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌。制成的商品有“促菌生”、“调痢生”、“止痢灵”、“增菌素”等。 　　（2）乳酸苗制剂：用于微生态制剂的酸乳杆菌主要是：嗜乳酸杆菌、植物乳酸杆菌、粪链球菌等。其共同特征是大量产酸。我国最早使用的乳酶生就是用粪链球菌制成的，商品有“抗痢灵”、“抗痢宝”。 　　（3）酵母类制剂：目前应用的主要有啤酒酵母和石油酵母。它可为动物提供蛋白质，帮助消化，对防治畜禽消化道系统疾病起有益作用。 　　（4）双歧杆菌制剂：双歧杆菌是寄生在人和动物小肠后段的正常菌群，起着维持微生态平衡的作用。 　　（5）拟杆苗制剂：拟杆菌是人和动物后肠道，在厌氧杆菌中占第一位的正常菌，上海华星生物工程研究所以脆弱拟杆菌、粪链球菌和蜡样芽孢杆菌制成的“华星宝”复合菌制剂对防治雏鸡、仔猪由沙门氏菌和大肠杆菌引起的下痢有较好的效果。? 　　4.2  微生物制剂面临的问题  微生态制剂临床应用尚有许多待解决的问题。 　　（1）目前尚无微生态制剂的药代动力学的系统描述，益生菌在肠道发挥作用的有效剂量及定植所需剂量无法明确。 　　（2）微生态制剂各制剂间菌数差异较大，反复筛选菌株种类、将基因重组技术引进微生态领域，增强菌株的定植能力，是很有意义的。 　　（3）缺乏对微生态制剂的认识和使用经验，尤其是大规模、多中心、随机和前瞻性临床试验少，评价种类也少。 　　（4）微生态制剂发挥作用确切的机制尚有待进一步阐明，目前提到的有：生态占位，定植抗力，生物夺氧，免疫调节，降低肠腔pH和细菌代谢产物抗菌作用等。每一种益生菌作用机理需进一步研究。 　　（5）大部分微生态制剂不能与抗生素合用，部分限制其临床应用。如果与抗生素合用，活菌也会产生耐药性，耐药因子是否被传递。?